Den sosialt utstøtte tenåringen Peter (Andrew Garfield) bruker dagene til å finne ut av mysteriet angående sin fortid, og til å vinne hjertet til ungdomsforelskelsen sin, Gwen Stacy (Emma Stone). En mystisk dokumentmappe som tilhørte faren, som forlot ham da han var barn, fører Peter til farens tidligere samarbeidspartner, Dr. Connors. Oppdagelsen av farens hemmelighet vil til slutt forme hans skjebne for å bli "Spider-Man", og stille ham ansikt til ansikt med Connors' grusomme alter ego, The Lizard.